Эндоксиланазы являются ферментами, расщепляющими ксилан - основной компонент гемицеллюлоз. В этой связи эндоксиланазы представляют большой интерес как в промышленности, так и прикладной биотехнологии. Для мицелиального гриба Penicillium canescens (далее Р. canescens) известна эндо-1,4-β-D-ксиланаза (XylA). Однако до настоящего времени не было известно о других эндо-1-4-β-D-ксиланазах, xylB, xylC, xylD, xylE, 10-го и 11-го семейств гликозил-гидролаз мицелиального гриба P. canescens.

Целью настоящей работы являлось создание штамма мицелиального гриба P. canescens - продуцента новой секретируемой эндо-1-4-β-D-ксиланазы xylD путем гомологичной экспрессии. Новая эндо1-4-β-D-ксиланаза получена путем клонирования и секвенирования мицелиального гриба P. canescens, конструирования рекомбинантной плазмиды pPCGXD, несущей ген xylD под контролем промотора гена β-галактозидазы. Для трансформации протопластов мицелиального гриба P. canescens РСE-7 (niaD-, xylA-) использовали плазмиды pPCGXD и pSTA-10, содержащей в качестве селективного маркера ген нитратредуктазы Aspergillus niger. Для отбора штаммов с повышенной активностью эндо-1-4-β-D-ксиланазы проводили глубинное культивирование и тестирование культуральных жидкостей на наличие соответствующей ферментативной активности. Активность эндо-1-4-β-D-ксиланазы в культуральной жидкости определяли по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе березового ксилана. Инкубацию субстрата и фермента проводили при 50C в течение 10 мин. При определении температурного оптимума инкубацию проводили в течение того же времени, но при разных температурах. При определении pH-оптимума дополнительно использовали 0.1 M ацетатные буферные растворы с различными значениями pH (от 3.0 до 7.0). За единицу активности принимали количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяли методом Шомоди-Нельсона. Для проверки эффективности полученного препарата фермента проводили обработку сульфатной лиственной целлюлозы после стадии КЩО (кислородно-щелочной обработки) предприятия Mondi Business Paper (Сыктывкарский ЛПК). В качестве сравнения использовали ферментный препарат Biobrite UHB (Канада). Условия обработки целлюлозы ферментным препаратом: рН (начальное значение) – 6-7, температура – 55-60оС, концентрация массы – 3,5% , время обработки - 60 минут.

Активность полученного ферментного препарата xylD составляла 190 ед./мл. Температурный и pH оптимумы ферментного препарата xylD составляли 500С и 4.5 соответственно. При обработке сульфатной лиственной целлюлозы Mondi Business Paper Сыктывкарский ЛПК после стадии КЩО ферментным препаратом xylD и последующей отмывки число Каппа достигала значения 8,2 в то время как при использовании Biobrite UHB (Канада) – 8,4. Таким образом, ферментный препарат эндо-1-4-β-D-ксиланазы xylD, продуцируемый новым рекомбинантным штаммом P. canescens сравним по физико-химическим характеристикам и эффективности отбелки лиственной целлюлозы коммерчески доступными ксиланазами.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт № 16.512.11.2150).