Оксидоредуктазы являются перспективными объектами биотехнологического применения: они высокоселективны и способны превращать инертные субстраты. Однако прогресс в области биотехнологического применения оксидоредуктаз сдерживается необходимостью введения акцепторов/доноров и кофакторов в реакционные смеси, а также необходимостью тщательного подбора условий реакции для протекания окислительно-восстановительного процесса в нужном направлении. Огромный потенциал имеют оксидоредуктазы для применения в медицинской диагностике и разработке новых лекарственных препаратов (дегидрогеназы и оксидазы), в биоремедиации окружающей среды (оксидазы и оксигеназы, дегалогеназы и гидроксилазы), а также в стереоселективном химическом синтезе (алкогольдегидрогеназы и дегидрогеназы аминокислот).

В рамках проводимых исследований нами охарактеризованы супероксиддисмутаза (СОД) из гипертермофильной археи Acidilobus saccharovorans (ген 0498), лейциндегидрогеназа (LeuDH) из термофильной археи Geoglobus sp. (ген 02156) и альдегиддегидрогеназа (AlDH) из термофильной археи Pyrobacullum sp. (ген 01147). Показано, что СОД относится к классу Fe-зависимых супероксиддисмутаз. Встраивание иона Fe(II) в активный центр СОД в анаэробных условиях приводит к росту активности и значительному повышению термостабильности фермента. Активность Fe(II)-активированного СОД составляет 1700 ед/мг при определении ксантиноксидазным методом [1] и превышает активность исходного препарата в 100 раз. После 66ч инкубации Fe(II)-активированного COД при 80°С сохраняется 50% активности фермента. Время полуинактивации фермента при 90˚С и 95˚С составляет 10 часов и 2 часа, соответственно.

LeuDH и AlDH являются НАД(Н)-зависимыми дегидрогеназами, причем LeuDH строго специфична к НАД, а AlDH строго специфична к НАДФ. Оба фермента термостабильны: максимальная активность в реакции окисления субстрата для LeuDH наблюдается при 80ºС, а для AlDH при 85ºС. При 80ºС время полуинактивации LeuDH составляет 2,5 ч., однако интересно, что в первые 30 мин наблюдается термоактивация, которая приводит к повышению активности фермента на 25%. По-видимому, наблюдаемое повышение скорости ферментативной реакции – термоактивация фермента- есть следствие конформационных изменений в активном центре фермента или в белковой глобуле целиком. Термоактивация свойственна термофильным ферментам и является следствием адаптации белка к высоким температурам. Прогревание AlDH при 75ºС приводит к активации фермента на 25%. Однако фермент нестабилен и дальнейшее прогревание приводит к падению активности на 50% через 30 мин.

Проведенный анализ субстратной специфичности обеих НАД-зависимых дегидрогеназ показал, что лейцин и его производные –изолейцин и норлейцин- являются субстратами LeuDH. Реакцию окислительного деаминирования проводили в 0,2 М Gly-буфере, рН 10,5 с добавлением 0,32 М KCl, 1,1 мМ НАД и 18 мМ субстрата. Реакцию инициировали добавлением 5-30 мкг фермента в 1 мл реакционной смеси. Каталитические константы ферментативного превращения для каждого субстрата составили, соответственно: 0,03*104 с-1, 0,13*104 с-1, 0,11*104 с-1. Минимальное значение Km показано для субстрата изолейцина и составляет (1.88±0.4) мМ. Характеристику субстратной специфичности AlDH в реакции окисления альдегидов проводили при температуре 65˚С в 0.1 М фосфатном буфере рН 8.5, 0.1М NaCl. В 1 мл рабочего буфера добавляли 0.2мМ НАДФ и 5-10 мМ альдегида (пропиональ, глицеральдегид, изобутиральдегид, пирувальдегид и хлобензальдегид). Наиболее активным в реакции окисления оказался изобутиральдегид: каталитическая константа и константа Михаэлиса для реакции окисления изобутиральдегида AlDH составили 2,0*104 с-1 и (0.028 ± 0.007) мМ, соответственно. В настоящее время продолжается характеристика фермента с целью оценки биотехнологического потенциала данных объектов.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт № 02.740.11.0765).

Список литературы

1.Malstrom, B., Andreasson, L., and Reinhammer, B. in The Enzymes. Byer, P., editor. XIIB, Academic Press, New York, 533 (1975).